1896年11月，蒙台梭利又兼任罗马圣神教堂医院的精神病临床助理医生一职。此间，她的大部分工作都是与穷人打交道，尤其是和穷人家的孩子打交道。作为一名医生，她对待病人的方式很受人关注，因为她在对病人进行诊断治疗的同时，十分注重保证病人的温饱。1897年，她自愿加入到罗马大学精神科发起的一项研究计划中，在那儿结识了共事的玖塞佩‧蒙特沙诺，并发展出一段情缘。

她的工作之一是探访罗马的避难所和疯人院，寻找并带回精神科治疗的对象。在某次探访时，儿童避难所的工作人员向她表示了对儿童用餐后会直接从地上抓起面包屑食用的这一现象的厌恶感。看着空无一物的房间，蒙台梭利意识到，这些孩子所处的环境剥夺了他们天生渴望的感官刺激，因而有了这样的境遇。

她开始尽其所能，阅读有关智力低下儿童的论文，更特别研读了十九世纪初两位著名法国学者尚-马克伊塔（以“阿韦龙省的野孩子”项目闻名）和爱德华塞根（尚-马克伊塔的学生）具有创见的著作。她十分迫切地希望理解二位的著作，便亲自将这些著作由法语翻译成了意大利语。伊塔发明了一种感官教育方法，后来塞根尝试将这种方法运用到主流教育中去。塞根批判了当时教条的教育制度，强调了尊重与理解对于每一个孩子的重要性。他设计了一套极具操作性的教学材料，帮助学生提高感官知觉与肌肉动作，蒙台梭利后来继承了这一方法，并在此基础上推陈出新。 1897-98年，她为了扩充教育学方面的知识，又在罗马大学里选修了教育课程，研读卢梭、裴斯泰洛齐与福禄贝尔等学者的著作。

1898年，她的避难所儿童救助项目受到了更多瞩目。年仅28岁的她受邀参加在都灵举行的全国医疗会议，并在会议上致辞。会上，她提出了引人争议的理论，主张智力低下与智力障碍者缺乏关爱，这是造成他们犯罪的主要原因。随后，她继续扩充她的理论，并于次年在全国教育会议上提出了根植于教育方法的社会进步与政治经济设想。透过教育进行社会改革的理念，在蒙台梭利往后的一生中逐步发展并日臻成熟。

蒙台梭利随后加入了全国迟缓儿童教育联盟，她与玖塞佩‧蒙特沙诺共同被任命为新机构“精神矫正学校”的主任。这所学校接收各种不同程度失常及残障的儿童。这一事件也成为了蒙台梭利由医生向教育工作者转变的重要转折点。在此之前，蒙台梭利关于儿童发展的想法仅停留在理论阶段，但这所小小的学校，作为一间教育诊所，给她提供了将理论变为实践的机会。在精神矫正学校工作的两年间，蒙台梭利抱着科学分析的态度，不断实验并完善伊塔和塞根设计的教学材料。她白天教学、观察儿童，晚上则将白天的所见所得全部录入笔记。

她与玖塞佩的关系逐渐发展成一段恋情，并于1898年产下一子，起名马里奥。她把孩子寄养在罗马近郊的一个家庭中。虽然玛利亚经常去看望儿子，但马里奥是在年纪稍长后才得知玛利亚是他的母亲这一事实的。母子情深，因此后来他不但和母亲合作、四处访问，更在她去世后克绍箕裘。

1901年，玛利亚离开了精神矫正学校，全身心投入到教育哲学及人类学的研究中去。1904年她受聘于罗马大学教育学院，直到1908年才离开。在一堂课上，她告诉学生：“我们学习的主题是人性；我们的目的是成为教师。现在，真正能使我们被冠以‘老师’这一称号的品质是对儿童的爱；因为只有爱才能将教育者的社会责任转化为更高级的使命感。”

当时的罗马发展迅速，在投机热潮下，一些建筑公司和地主倒闭破产，一些未完成的工地项目很快变成违章住宅。其中，位于圣洛伦佐区的一处建筑项目被一个富有的银行家集团出面挽救，这个工地被改建成了公寓集团住宅，供贫困劳工家庭居住。由于父母成天在外工作，年幼的孩子便对新完工的建筑恣意破坏。于是，开发商便向蒙台梭利博士求救，希望她能给孩子找些事做，以免他们再破坏房舍。

蒙台梭利抓住了这次和正常儿童一起工作的机会，带来了一些在精神异常学校发展出来的教具，于1907年1月6日正式创建了第一所“儿童之家”(Casa dei Bambini)。儿童之家开幕时举行了一个小型的开幕仪式，但几乎没有人对这个机构抱有任何希望。蒙台梭利却不以为然，她说：“我有一个预感，因此我再三强调，这里见证着一个将来会举世闻名的创举的开端。”

她放手一试，一开始在儿童的环境中放置了许多物品，但最终只将孩子喜爱的物品保留了下来。蒙台梭利意识到，如果环境中的活动安排是支持儿童自然发展的，那么这样的环境将更能培养孩子的自我教育能力。后来她将这一教育方法命名为“自发教育”(auto-education)。她在1914年写到：“我发明的并不是一种教育方法，我只是让一些儿童有机会活下去而已。”

截至1908年秋天，她已先后开办了五所儿童之家，其中四所位于罗马，一所位于米兰。在儿童之家学习的孩子，个个进展神速。很快地，5岁大的孩子便已经能够读写。有关蒙台梭利新教学法的消息不胫而走，许多人慕名前来，希望亲眼目睹她是如何获此成效的。一年内，瑞士的意大利语区逐渐开始将现有的幼儿园转变成儿童之家，这一新教学法也由此开始在世界上广泛传播。

1909年夏天，她首度开班授徒，对大约100名学生传授了这种新的幼儿教育法。她这段时间的笔记，后来被编成了第一本关于她的著作 –《蒙台梭利教育法》，并于同年在意大利出版。随后，该书被翻译成英语，于1912年在美国出版，一跃成为美国非文学类畅销书单的第二名。稍后，这本书被翻译为20多种语言，成为教育界最有影响力的经典著作之一。

1912年12月20日，蒙台梭利的母亲去世，享年72岁。丧母之恸使玛利亚深受影响，因此次年她便将她14岁的儿子马里奥带回罗马一起生活。

接下来，蒙台梭利教学法进入了广为传播的阶段。各种蒙台梭利学会、培训课程及学校，在全球各地如雨后春笋般茁生，蒙台梭利博士也因此四处奔波，演讲、授课。她的主要目的地是美国，但她的足迹也遍及英国与欧洲各地。这时，蒙台梭利博士已经放弃了其他工作，专心投身到这种新教育法的传播中。然而，大部分扩展活动的基础都不牢固，并因第一次世界大战的烽火受到扭曲。

1917年，蒙台梭利自美国返回欧洲后，将其主要基地转移到了西班牙的巴塞罗那，她在当地成立了一个“教育研究实验室”(Seminari Laboratori de Pedagogia)。当时，马里奥也与其第一任妻子海伦克里斯蒂结婚。她的儿子儿媳相携来到西班牙，四个孙辈也相继在西班牙出生：两个孙子分别起名为小马里奥和罗兰多，两个孙女分别起名为玛丽莲娜和瑞尼尔德。其中最年幼的瑞尼尔德先后出任上一届国际蒙台梭利协会（Association Montessori Internationale，简称AMI）的秘书长和主席。国际蒙台梭利协会是玛利亚蒙台梭利于1929年创立的从事蒙台梭利教育法研究与传播工作的机构。

玛利亚希望创设一个研究并发展她早期教育教学法理念的常设据点，但她在西班牙期间，每一次的契机都因欧洲法西斯主义的猖獗而受挫。1933年，德国境内的所有蒙台梭利学校被勒令关闭。在柏林，她的肖像与成堆的著作被引火焚毁。

1934年，墨索里尼要求蒙台梭利与其合作，将意大利的所有蒙台梭利学校纳入法西斯青年运动。遭到蒙台梭利的严词拒绝后，墨索里尼强制关闭了意大利全境的蒙台梭利学校。随后，西班牙爆发内战，迫使蒙台梭利一家不得不弃置位于巴塞罗那的家园，于1936年夏天举家迁往英国。离国丧家之后，他们又辗转从英国迁往荷兰，留住在荷兰银行家之女艾达皮尔森家中。当时马里奥已与前妻仳离，后来与艾达再结连理。

1939年，马里奥陪同玛利亚到印度旅行，并在巡回演讲之后，于印度马德拉斯市进行了为期三个月的培训课程。但这一去，却使得他们七年无法返回欧洲。随着战争的爆发，身为意大利公民的蒙台梭利家族也受到牵连，马里奥被监禁，玛利亚也遭到软禁。某年夏天，她到科代卡纳尔避暑，那一段经历引导她开始思考所有生物间的关系。这是她直到终老前都一直在不断省思的一个主题，后来衍生为“宇宙教育(cosmic education)”，也就是她为6-12岁儿童制定的学习主轴。蒙台梭利在印度期间，受到良好照顾，也会晤了甘地、尼赫鲁与泰戈尔等名人。在她七十大寿时，她向印度政府提出的释放马里奥的请求获得批准，母子俩随后又携手培训了数以千计的印度教师。